Uns interessiert: -
Welcher Auxinrezeptor ist mit der
Aktivierung von PLA verknüpft? -
Welches PLA Enzym ist an welcher Funktion beteiligt – Auxin oder Pathogen? -
Wie wird das PLA Protein aktiviert? -
Mit welchen Partnern der Signaltrans-duktionskette
steht Phospholipase A direkt in Wechselbeziehung? Dafür nutzen wir: -
Promotor –GUS- Pflanzen zur Transkript-
Lokalisation -
Knockout- Pflanzen und Überexprimierer um
zu bestimmen, welche Funktion beein-trächtigt,
verbessert oder verändert ist -
Charakterisierung von Knockout- Pflanzen auf funktioneller und Transkript- Ebene -
Herstellung rekombinanter Phospholipase A und nachfolgende Bestimmung enzyma-tischer und anderer Eigenschaften Einführung Pflanzen verfügen über zwei
Hauptgruppen von Phospholipase A (PLA)- Enzymen,
die sekretorischen PLAs
(sPLA) und die Patatin-
ähnlichen PLAs, von denen einige ursprünglich als
vakuolische Patatine
definiert wurden, jedoch auch zytosolische Patatin-
ähnliche PLAs einschließen. Eine Funktion für sekretorische
PLAs und Patatine in
der Hormon-Rezeptor-aktivierten Signaltransduktion scheint aufgrund ihrer Lokalisation
in Zellwand oder Vakuole weniger wahrscheinlich
zu sein. Es wurden jedoch
verschiedene Patatin- ähnliche PLAs im Zytosol, in Chloroplasten sowie teilweise an Endomembranen
gebunden identifiziert, die als Kandidaten für die Signaltransduktionsprozesse
in Pflanzen in Frage kommen. Phospholipase A PLA als ein Enzym der Signaltransduktionskette in Pflanzen wurde durch unsere
Abteilung entdeckt. In Arabidopsis thaliana wird die Familie der zytosolischen,
Patatin- ähnlichen PLAs
durch 10 Gene kodiert (Abb. 1). Phospholipase A
wird sehr schnell, d.h., innerhalb von 1-3 Minuten durch das Phytohormon Auxin und durch Elicitoren aktiviert, deutlich schneller als jede
Transkription. PLA Enzyme setzen Fettsäuren und Lysophospholipide
als potentielle second messenger frei, welche
wahrscheinlich Proteinkinasen und / oder
Proteinphosphatasen aktivieren oder inaktivieren. Sie könnten auch an der
Regulation anderer Proteine beteiligt sein, wie z.B. an der von Ionen-
Kanälen, wie aus tierischen Systemen bekannt.
Abbildung
1:
Phylogenetischer Baum verschiedener Patatin-
ähnlicher
Pflanzen- PLAs und tierischer iPLA2
Sequenzen.
Transkriptionsstudien an
Promotor-GUS-Pflanzen geben Hinweise auf die Funktion
der Gene.
Abbildung 2: Lokalisieren von Gen- Expressionen in Promotor- GUS-
Pflanzen: Um die Regulation eines
Gens auf Transkriptebene zu untersuchen, wird ein
künstliches Konstrukt aus gen- spezifischem Promotor und dem ß- Glucuroni-dase (GUS)– Gen erzeugt. Einmal aktiviert, verstoffwechselt dieses Enzym ein spezifisches,
farbloses Substrat, wobei ein indigoähnliches blaues Produkt entsteht, das
am Ort der Bildung ausfällt. Histologische Lokalisation der Promotor-GUS-
Aktivität von zwei PLA-Genen in Arabidopsis-
Pflanzen: Gen IVA nur in Wurzeln; Gen IIA in allen Organen außer in Blüten.
Reaktionen von IAA auf a) keine
Behandlung; b) Salicylat c)
Verwundung; d) keine Behandlung;
e) Phosphatmangel; f) Eisenmangel;g) Ethylen (über ACC);
Petunien, Phospholipase A und Pathogenabwehr
Das Petunien-Projekt ist
sowohl Gegenstand der angewandten als auch der Grundlagenforschung, dabei
dient die Petunie als
Modellorganismus für Zierpflanzen. In der Zwischenzeit wurden in unserer
Abteilung etwa 50 Petunien-Linien
kreiert, welche mit 4 verschiedenen PLA- Genen aus Arabidopsis thaliana
transformiert wurden. Petunienpflanzen, welche 3 dieser 4 PLA- Gene überexprimieren, zeigen veränderte Eigenschaften bei
der Abwehr von Pathogenen (Abb. 3).
Abbildung 3: Phytopathologische Unter-suchungen
an AtPLA-
Gen- transformierten Petunien: Abgebildet sind Blätter mit makroskopisch wahrnehmbaren Krankheitssymptomen nach
erfolgreicher Infektion mit dem Pilz Botrytis cinerea (Grauschimmel) bzw. mit dem
pathogenen Bakterium Pseudomonas syringae PST
DC 3000.
Die Ergebnisse der phytopathologischen
Experimente beweisen eine Beteiligung dieser PLA- Gene/Proteine an der
Abwehr gegen Pseudomonas syringae
und Botrytis cinerea.
Mithilfe von Microarrays (in Zusammenarbeit mit
A. van Tunen und R. Schmirink, Freie Universität
von Amsterdam) wurden Abwehr- Gene in Petunien
identifiziert, deren Transkription
abhängig ist von den überexprimierten PLAs (Abb. 4).
Abbildung
4: Überexpression
von Phospholipase A- fürhrt
zu einer veränderten Pathogenabwehr, sichtbar an den verstärkten
Krankheitssymptomen in transgenen Petunien- Pflanzen. Mithilfe von cDNA Microarrays werden
Gene mit abweichender Regulation detektiert, so können Rückschlüsse auf die
Beteiligung von PLA
an verschiedenen Signaltransduktionswegen der
Pathogenabwehr gezogen werden.
Cytokinin/Polyamine und Stickoxid (NO)
Obwohl Cytokinine bereits seit mehr als
50 Jahren bekannt sind, ist der Modus der zellulären Signaltransduktion
dieser Pflanzenhormone noch immer wenig geklärt. Das gegenwärtige Modell
geht von einer Beteiligung von Rezeptor-Histidin-Kinasen,
Histidin-Transfer-Proteinen und Typ B ARR
Transkriptionsfaktoren aus. In unserer Abteilung wurde kürzlich eine Rolle für Stickoxid (NO)
als potentieller second messenger für Cytokinin in der Form festgestellt, als dass die Cytokinin- induzierte NO- Biosynthese in Arabidopsis
deutlich eher einsetzt (innerhalb von 2-3 min) als jede bekannte Genaktivierung.
Abbildung 5: NO- induzierte Fluoreszenz, wie sie durch
Fluoreszenzmikroskopie in Arabidopsis- Keimlingen beobachtet wird, nachdem diese
mit Cytokinin behandelt wurden. Das freigesetzte
NO wird mithilfe des zellpermeablen DAR-4M AM Fluoreszenzfarbstoffs
sichtbar gemacht.
Wir wollen aufklären: -
Inwiefern ist die
NO- Biosynthese mit dem bekannten Cytokinin-
Rezeptor verknüpft? -
Welches der zwei
für die NO- Biosynthese bekannten Enzyme ist an der Cytokinin-
Wirkung beteiligt? -
Welche Cytokinin- Funktion wird durch NO reguliert? Für die fluorimetrische Messung der NO-
Freisetzung verwenden wir entsprechende Arabidopsis Knockout- Linien.
Das Cytokinin- induzierte NO wird durch
Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht (Abbildung 5). Die Cytokinin-/ NO- abhängige Genregulation
wird unter Nutzung von Promotor- GUS-Pflanzen und mittels RT-PCR
untersucht.
Polyamine zeichnen sich durch hormonartige Aktivitäten bei der
Embryogenese, bei Blühvorgängen und bei der Stress- und Abwehrantwort aus.
Wir haben festgestellt, dass Polyamine
unverzüglich die Biosynthese von Stickoxid in Pflanzen induzieren. Unter
Verwendung von Mutanten und Knockout- Pflanzen untersuchen wir gegenwärtig: -
Welches ist das
relevante Enzym für die Polyamin- induzierte NO-
Biosynthese? -
Was könnten die downstream- Aktionen des Polyamin-
inuzierten NO sein?
DLR-BMBF Projekt
zur Weltraum- und Gravitationsforschung
(in Zusammenarbeit mit Dr. H. Quader, Universität
Hamburg)
Die Wahrnehmung der Schwerkraft erlaubt
es Pflanzen, ihre Organe durch Wachstumsbewegungen in eine bestimmte
Richtung zur Erdbeschleunigung zu bringen, Wurzeln werden zum
Erdmittelpunkt hin bewegt, Sprosse vom Erdmittelpunkt weg (Gravitropismus). Die Wurzelhaube ist zum Beispiel mit
Zellen (Statozyten) ausgestattet, die
Gravitations-Rezeptoren enthalten, sogenannte Statholiten. Diese Sensoren sind Organellen (Amyloplasten), die aus Stärkekörnchen bestehen. Gravitation wird auch von anderen
Zellen erkannt, wahrscheinlich von allen eukaryotischen
Zellen, aber diese Zellen „nutzen“ diese Information nicht, um spezielle
Funktionen, wie den Gravitropismus, auszuüben.
Wir wollen herausfinden, ob diese „unspezifische“ Gravitationswahrnehmung
durch die Zellen die Grundlage für die „spezifischen“ Reaktionen wie den Gravitropismus darstellt. Es wurden Systeme gefunden, um die
“unspezifische” Gravitationswahrnehmung als eine Beeinträchtigung ihrer
normalen Funktionen zu veranschaulichen. 1.
Pollenschläuche
von Nicotiana sylvestris
führen eine schnelle Phospholipid- Endocytose aus, die durch Schwerelosigkeit (Microgravity) beschleunigt wird (TEXUS 39, folgendes
Experiment TEXUS 41). Endocytose wird durch
übertriebene Schwerkraft (Hypergravity) gehemmt. 2.
Die Toleranz von Pflanzen gegenüber hohen Salzgehalten
(Halotoleranz) wird durch übertriebene Schwerkraft gesteigert. Wir
untersuchen dieses Phänomen durch Zentrifugationsexperimente
mit Arabidopsis-
und Karotten- Kalluskulturen bei paralleler Messung des Wachstums. In
Zukunft werden wir Arabidopsis
Halotoleranz- Mutanten soweit untersuchen, dass wir definieren können,
welcher Schritt modifiziert ist, oder benötigt wird, um diese Reaktion
auszulösen. 3.
Gravitropismus und Zirkumnutation wirken in Arabidopsis wechselseitig
aufeinander ein, wie an einer pla1
Knockout-Mutante gezeigt werden konnte. Diese Mutante ist sowohl im Sprossgravitropismus als auch im Phototropismus
geschädigt. In den Wurzeln konnte keine offensichtliche Schädigung im Gravitropismus beobachtet werden, jedoch ist die so
genannte Coiling- Reaktion (Abb. 6) deutlich
stärker, was eine Änderung in der Zirkumnutation
widerspiegeln könnte. Diese Mutante wird
im Jahr 2008 mit einem Space Shuttle auf die
Internationale Raumstation ISS geflogen, und das Wachstumsverhalten der
Wurzeln wird bei 10-6 g, 10-4 g, 10-1 g
and 1 g im Orbit verfolgt. Durch den Vergleich werden wir in die Lage
versetzt, das Zusammenspiel von Gravitropismus
und Zirkumnutation zu verstehen. Außerdem
untersuchen wir die pla1 Knockout-Mutante
am Boden mit molekular- und zellbiologischen Methoden (GUS- Pflanzen,
Knockout- Linien, Überexprimierer- Linien,
Antikörper für das PLA- Protein, Interaktion mit anderen Genen).
Weltraumflüge: Im TEXUS 39, (Mai 2001) während
eines 6 Minuten langen Raketenfluges in Kiruna
(Schweden) konnten wir zeigen, dass die Endozytose
in Tabakpollenschläuchen bei Fehlen der Schwerkraft stark erhöht ist (Abb.
7). (Teilnehmer: Saskia Lisboâ
(Hamburg), Martin Pähler, Esther Oppermann) Im TEXUS 41 (Nov. 2005):
Fortführung der Studie zur Endozytose in
Pollenschläuchen einschließlich der Verwendung von Kalziumblockern und Zytoskelettblockern. (Teilnehmer: Marc Zahn, Peter Pietrzyk, Ni Ni Tun) Space Shuttle / ISS (geplant für 2008): Wachstumsmuster der Wurzeln von Arabidopsis-
Keimlingen werden unter verschiedenen Schwerkraftbedingungen (normale
Schwerkraft = 1 g, 0.1 g, 0.001 g and <0.0001 g = Microgravity)
dokumentiert. Die Versuche schließen außerdem zell- und
molekularbiologische Methoden ein, um die Interaktion von Zytoskelett und PLA1 Protein zu untersuchen. Abbildung 6: Auf um 45° geneigten Agarplatten
unter normaler Schwerkraft (1g)
zeigen Wurzeln von agravitropen Arabidopsis
Mutanten ein spiralförmiges Wachstumsmuster, die so genannte
”Coiling- Reaktion”. Dieses Kringeln der
Wurzel in einer Spirale ist
scheinbar auf ein Wachstums- Ungleichgewicht zwischen dem inneren Gewebe
(Leitbündel) und dem äußeren rhizodermalen Gewebe
zurückzuführen, ähnlich dem Wachstums- Ungleichgewicht, das als Zirkumnutation bekannt ist.
Abbildung 7: Vesikeltransport und Lipid-
Endozytose in Pollenschläuchen von Nicotiana
sylvestris in Schwerelosigkeit: Um die Endozytose in einem
Kurzzeit-Schwerelosigkeit- Experiment zu studieren, wurde ein
fluoreszenz-markiertes Phospholipid als Indikator verwendet. Die
Endozy-tose ist deutlich ausgeprägt in der Spitze von Pollenschläuchen, die
Fluoreszenz des Phospholipids ist bereits nach einer Minute mit dem
Konfokalen Laserscanning Mikro-skop nachweisbar.